蛋白純化是指通過(guò)基因工程技術(shù)將編碼蛋白的核酸序列導(dǎo)入到宿主細(xì)胞，使其大量表達(dá)，再使用適當(dāng)?shù)募兓椒▽⑵湓隗w外純化出來(lái)，從而獲得高純度、活性和產(chǎn)量的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)可以分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)兩大類，我們今天主要來(lái)看下原核表達(dá)系統(tǒng)！

乳糖操縱子的神奇開(kāi)關(guān)：

原核系統(tǒng)的核心秘密藏在lac操縱子！平時(shí)阻遏蛋白鎖死基因表達(dá)，但加入IPTG后秒變超級(jí)開(kāi)關(guān)——這個(gè)穩(wěn)定耐造的誘導(dǎo)劑能騙過(guò)細(xì)菌，24小時(shí)持續(xù)激活蛋白表達(dá)，產(chǎn)量直接拉滿！

Figure 1  乳糖操縱子和IPTG原理示意圖

宿主菌株怎么選？

BL21：新手友好型！適合普通非毒性蛋白，具有大腸桿菌聚合酶，故可適用于tac或trc等使用大腸桿菌RNA聚合酶的原核系統(tǒng)的表達(dá)（如：pGEX，pMAL質(zhì)粒）。

BL21(DE3)：雙引擎驅(qū)動(dòng)！在BL21菌株的染色體上整合了λ噬菌體DE3區(qū)的T7噬菌體RNA聚合酶基因，加上大腸桿菌RNA聚合酶，適配pET系列，pGEX，pMAL等高端質(zhì)粒。

重要Tip：DE3菌株遇到毒性蛋白會(huì)自我毀滅，記得改用特殊菌株如：BL21 AI、BL21 (DE3) pLysS、BL21 (DE3) pLysE、Lemo21(DE3)、C41(DE3)、C43(DE3)和M15 pREP4。

蛋白純化四部曲：

1. 基因改造：His標(biāo)簽/NusA融合，給蛋白裝上GPS！PCR擴(kuò)增目的基因，雙酶切基因片段與載體后連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，挑取單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)，涂布含抗生素LB平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)

2. 誘導(dǎo)表達(dá)：挑取單克隆接種于3 mL LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12-16 h。按1:1000比例轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6-0.8時(shí)，設(shè)置梯度誘導(dǎo)體系：分別考察IPTG濃度（0.1-1.0 mM）與誘導(dǎo)溫度（16℃、30℃、37℃）的協(xié)同效應(yīng)，其中低溫誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)至16-20 h（16℃）或6-8 h（30℃）。通過(guò)SDS-PAGE分析誘導(dǎo)前后菌體蛋白表達(dá)差異，篩選可溶性表達(dá)最佳條件。

3. 大規(guī)模蛋白誘導(dǎo)與菌體收集：采用優(yōu)化條件進(jìn)行2 L規(guī)模發(fā)酵。菌體離心（4000 g，4℃，15 min）后按1:10 (w/v)比例加入預(yù)冷的裂解緩沖液（含1% Triton X-100，20 mM咪唑及蛋白酶抑制劑），冰浴30 min。高壓均質(zhì)儀于800 kPa壓力下循環(huán)破碎3-5次，直至菌液透明度顯著增加。離心收集上清（12000 g，4℃，20 min），分離可溶性與包涵體組分。

4. 親和層析：使用Ni-NTA樹(shù)脂進(jìn)行金屬螯合層析。首先用5倍柱體積裂解緩沖液平衡層析柱，將含有His標(biāo)簽蛋白的裂解上清與樹(shù)脂4℃結(jié)合2 h。依次用含40 mM、60 mM咪唑的洗滌緩沖液去除雜蛋白，最后用250 mM咪唑洗脫緩沖液分步洗脫目的蛋白。全程收集各階段流出液進(jìn)行SDS-PAGE監(jiān)控。

Figure 2  原核表達(dá)系統(tǒng)純化蛋白全流程

為什么選His標(biāo)簽？

組氨酸標(biāo)記（His-tag）是最常用的標(biāo)簽之一，通過(guò)在蛋白N端或C端添加6-10個(gè)組氨酸殘基，使其能夠特異性結(jié)合Ni²⁺螯合介質(zhì)。該結(jié)合作用在非變性或變性條件（如8M尿素）下均穩(wěn)定存在，最終通過(guò)咪唑溶液競(jìng)爭(zhēng)性置換結(jié)合His-tag的Ni²+，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的特異性洗脫與純化。

關(guān)鍵優(yōu)化策略
（1）采用低溫誘導(dǎo)（16℃）結(jié)合低濃度IPTG（0.2 mM）有效提升可溶蛋白比例

（2）在裂解緩沖液中添加0.5 M精氨酸顯著減少非特異性吸附

（3）梯度咪唑洗滌（20-60 mM）使純度提高約35%。

原核表達(dá)雖“快準(zhǔn)狠”，但復(fù)雜蛋白（如含二硫鍵、翻譯后修飾）建議轉(zhuǎn)向真核系統(tǒng)哦！

普健生物（AtaGenix）專注于蛋白抗體開(kāi)發(fā)，其核心優(yōu)勢(shì)之一是成熟高效的五大蛋白表達(dá)系統(tǒng)，覆蓋原核與真核體系，可滿足不同蛋白的表達(dá)需求。大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)有表達(dá)量高，成本低，周期短，發(fā)酵工藝成熟等優(yōu)勢(shì)，真核表達(dá)系統(tǒng)包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞（支持復(fù)雜翻譯后修飾，適合抗體藥物、Fc 融合蛋白）、昆蟲(chóng)細(xì)胞（超大分子兼容性，如跨膜蛋白和病毒樣顆粒）、酵母（高密度發(fā)酵，中等復(fù)雜度蛋白）及植物細(xì)胞（安全性高、規(guī)?；a(chǎn)治療蛋白），滿足從基礎(chǔ)研究到藥物開(kāi)發(fā)的多樣化需求。