一、需求分析

　　客戶需求：可提供蛋白序列，希望得到純度85%左右的500μg蛋白，蛋白后續(xù)用于酶活實驗，項目預算有限，后期可能需要大量蛋白。

　　需求分析

　　如項目預算有限，建議優(yōu)先選擇原核表達系統(tǒng)，成本較為低廉，如后續(xù)需要進行大體積放大，可直接進行發(fā)酵，工藝成本更低;對于酶的表達，普健的大腸桿菌表達系統(tǒng)在已往項目中有較為積極的客戶反饋; 基于以上分析，普健建議該項目選用大腸桿菌表達系統(tǒng)。

二、蛋白性質(zhì)分析

　　將蛋白序列在蛋白數(shù)據(jù)庫Uniport中比對，一致性較高為80.9%，用生物信息學工具進行蛋白性質(zhì)分析。

　　跨膜結(jié)構域預測：

 

　　信號肽預測：

 

　　疏水性預測：

 

    蛋白性質(zhì)總結(jié)：客戶提供蛋白序列一共234 AAs，蛋白大小為25.39 KDa，pI為8.80，疏水性一般，無跨膜結(jié) 構域，無信號肽，無糖基化及二硫鍵修飾。

三、實驗設計

　　綜合蛋白性質(zhì)及客戶需求分析，設計蛋白表達方案如下：選擇大腸桿菌表達系統(tǒng)，表達目的蛋白全長，N端融合6*His標簽，表達載體為pET28b，選用BL21(DE3)、T7E為表達菌株，設置多個誘導溫度及誘導時間，根據(jù)表達測試結(jié)果，選擇最優(yōu)條件進行200mL放大，收集樣品采用Ni柱純化，交付蛋白樣品。

四、實驗方法及實驗結(jié)果

　　1、表達載體構建

　　利用生物信息學工具對目的蛋白全長片段進行密碼子優(yōu)化，降低稀有密碼子水平，用化學合成方法獲得目的蛋白基因序列片段，將片段亞克隆到pET28b表達載體，進行雙酶切驗證及測序確認。進行雙酶切驗證及測序確認。

　　測序結(jié)果：

 

　　雙酶切驗證結(jié)果：

 

      結(jié)果分析：NdeI/XhoI雙酶切測試結(jié)果顯示片段大小正確，測序結(jié)果顯示序列一致，確認蛋白表達載體構建成功。

　　2、表達測試

　　將表達載體轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株、T7E菌株，挑取陽性克隆轉(zhuǎn)移到含Kana抗性的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3-4h，加入1mM IPTG誘導表達，一組37℃培養(yǎng)4h，另一組16℃培養(yǎng)16h過夜，收集蛋白樣品進行SDS-PAGE檢測。

　　SDS-PAGE結(jié)果：

 

　　結(jié)果分析：根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，蛋白大小在25KD左右，與預測蛋白大小相符，比較各條件下蛋白表達情況，確認該蛋白最優(yōu)的表達條件如下：

菌株	溫度	誘導時間
T7E 菌株	37℃	4h

　　3、放大純化

　　按照得到的最優(yōu)表達條件，轉(zhuǎn)化200mL大腸桿菌，37℃培養(yǎng)3-4h，1mM IPTG誘導后，37℃培養(yǎng)4h，收集蛋白樣品，用Ni柱進行蛋白純化，得到最終蛋白樣品。

　　4、QC檢測

　　將最終得到的蛋白樣品進行濃度測定、SDS-PAGE檢測及His標簽抗體的WB檢測。

　　SDS-PAGE檢測及WB檢測結(jié)果：

                

 

結(jié)果分析：SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白大小在25KD左右，且蛋白純度較好，約為95%; His標簽抗體的WB檢測結(jié)果顯示25KD左右曝出條帶，與目的蛋白預測大小相符。

五、交付材料

序號	樣品	濃度	分裝	緩沖液	管數(shù)
1	蛋白	1.00mg/ml	1.50ml/管	PBS pH7.5	2管
2	表達載體	100ng/ul	15ul/管	TE	1管
3	表達菌株	/	1.00ml/管	/	1管
合計管數(shù):					4管

六、項目結(jié)題

　　從基因合成到交付蛋白樣品，項目為期5周，得到3.00mg目的蛋白樣品，由于酶活測試的多樣性與特殊性，交付給客戶進行驗收及酶活測試，客戶驗證蛋白大小純度均與QC結(jié)果一致，酶活實驗結(jié)果表明蛋白有生物活性，綜上，項目順利結(jié)題。

 

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